本文记录了分子生物学实验室的基本操作流程，包括质粒构建、细菌转化、细胞转染及 PCR 鉴定等步骤。

一、质粒构建与细菌操作

1. 设计

设计相应效用的质粒，并确立切割、连接方案。（原则：尽量用已有质粒）

2. 摇菌

  1. 配比：15ml LB + 30μL AMP（比例 500：1）。
  2. 接种：枪头蘸取对应甘油菌（30% 的甘油 + 对应菌）。

3. 提取质粒

  1. 公用高速离心机离心成菌沉 10min X 12000g。
  2. LB 培养基倒专属瓶子，加入泡腾片后倒入水道。
  3. 根据试剂盒说明书加入P1或E1等试剂，具体看说明书，不同菌有不同处理方式

4. 切割（若有）

  1. 确立切割酶的最佳效用时间和活性 Buffer。
  2. 体系配比（4x体系）：
    • DNA：XXX ng
    • Buffer：5 × 4 μL
    • 切割酶：4 μL
    • ddH2O：补至 50 μL
  3. PCR 仪培育切割（先根据NEB的数据库设计酶切时长和温度，酶切结束后放入4℃冰箱保存）。

5. 跑胶与回收

  1. 0.6% / 0.8% / 1% 琼脂糖凝胶，1.5 μL 染料。💡 跑胶示例
  2. 切割回收。
    （1）取1.5ml或2ml离心管称重，记录空管重量
    注：从这一步开始，按试剂盒的说明书进行，以下为其中一种方案
    （2）将电泳分离后的凝胶放在紫外灯下，快速切下含有目的DNA片段的凝胶，并尽可能去除多余的凝胶
    （3）称取凝胶块的重量，并转移至上述1.5ml或2ml离心管中，按100mg凝胶块相当于100μl体积计算，加入1 ~ 1.5倍体积Buffer GDP，50 ~ 60℃水浴10 ~ 15min，让凝胶块完全溶解。水浴期间，颠倒混匀3次加速溶解
    （4）短暂离心收集管壁上的液滴，将HiPure DNA Mini Column I 套在收集管中，把≤700μl转移至柱子（即HiPure DNA Mini Column I）中。12000xg离心60s
    （5）（可选：溶胶液超过700μl，即有剩余溶液）倒弃滤液，把柱子套回收集管中，把剩余溶胶液转移至柱子中。12000xg离心60s
    （6）倒弃滤液，把柱子套回收集管中。加入600μlBuffer DW2（已用无水乙醇稀释）至柱子中。12000xg离心60s
    （7）倒弃滤液，把柱子套回收集管中。加入300μlBuffer DW2（已用无水乙醇稀释）至柱子中。12000xg离心2min
    （8）把柱子套在1.5ml离心管中，加入15 ~ 30μl Elution Buffer至柱子膜中央。放置2min。12000xg离心1min💡 如果要获得最高产量需要重复洗脱
    （9）丢弃柱子，将DNA保存在-20℃冰箱

6. 转化细胞

  1. 转化体系（配制后室温 10min 或 16℃ 过夜）：
    • 载体：50 ng
    • 片段：50 ng（双酶切片段）
    • 10x T4 buffer：1 μL
    • T4 连接酶：1 μL
    • ddH2O：补至 10 μL
  2. 同时，感受态细胞取出，10min 冰上待用。
  3. 预热水浴锅、取出 SOC 培养基。
  4. 取 50 μL 感受态细胞 + 5 μL 转化体系，10min 冰上待用。（剩余 5 μL 转化体系转至 16℃ 保温，最多 24h，之后转入 -20℃ 保存或丢弃。）
  5. 热激：42℃ 水浴 45s，随后 2min 冰上待用。
  6. 超净台操作：加 200 μL SOC。
  7. 复苏：取出培养皿，后一起放于摇床（DH5α 细胞 37℃ 1h，stbl3 细胞 30℃ 1.5h）。

7. 涂板

分 150 μL、50 μL 规格，涂板结束后倒置放入摇床 37℃，20h。

8. 划菌

准备 3 个 14ml 摇菌管（每管加 3ml LB，剩余保存常温），同样配比。

9. 摇床培养

37℃，16h。

10. 保菌

  • 1.5ml 保存管：甘油 500 μL + 菌液 500 μL， -80℃ 保存。
  • 2ml 管：全倒，标记 TDGH 1-3。

11. 质粒小提

2ml 菌液，13000g 离心 10min（2次），进行小提小量， -20℃ 保存。

12. 鉴定

（此处进行酶切或 PCR 鉴定）

二、细胞实验操作

复苏细胞

  1. 从液氮罐中取出细胞冻存管（Cryovial），放入预先准备好的水浴锅的水的罐子中，迅速转移到细胞房内。
  2. 将细胞转移到含有10 ml预热的++DMEM 培养基的15 ml 离心管中，离心1000RPM 5min
  3. 取6 μL DMEM 培养基（+++）到T25培养瓶中，等待离心结束
  4. 丢弃上清液，保留沉淀，用 2 ml DMEM 培养基（+++）重悬细胞沉淀，将重悬液转移到上述T25培养瓶中
  5. 写好细胞名称，代数（P1），日期，实验员

细胞传代

+++10%培养基预热
取3x5ml移液管：

  1. 抽出旧培养基
  2. 伸到底部加入5ml的DPBS，十字摇晃，抽走DPBS
  3. 新培养瓶加入4.5ml培养基，移液管留着
  4. 加入TP蛋白酶，细胞大面积脱落后加5ml培养基终止反应，得细胞悬液
  5. 移液枪转移0.5ml细胞悬液到新培养瓶

细胞冻存

准备+++10%培养基，FBS胎牛血清，DMSO

按照以下比例配冻存液

溶液 比例
+++10%培养基 70%
FBS胎牛血清 20%
DMSO（最后加入） 10%

混合+++10%培养基和FBS胎牛血清，在第9步加入DMSO
一般情况下，在细胞传代时，将旧的细胞悬液直接冻存

  1. 抽出旧培养基
  2. 伸到底部加入5ml的DPBS，十字摇晃，抽走DPBS
  3. 新培养瓶加入4.5ml培养基，移液管留着
  4. 加入TP蛋白酶，细胞大面积脱落后加5ml培养基终止反应，得细胞悬液
  5. 移液枪转移0.5ml细胞悬液到新培养瓶

从一步开始，与细胞传代不同
6. 将旧培养瓶中剩余的细胞悬液全部转移到15ml离心管中
7. 离心1000rpm 5min，去掉上清液
8. 用 +++10%培养基和FBS胎牛血清 混合液重悬细胞沉淀
9. 按比例（10%）加入DMSO，混匀，按1ml/管分装到冻存管中
10. 放在-80℃冰箱中过夜，第二天转移到液氮中保存

1. 铺板

耗材：3x5ml移液管，1x25ml移液管
预热++10%培养基

  1. 用一支5ml移液管抽取旧培养基，丢弃到废液缸
  2. 伸到底部加入5ml的DPBS缓冲液，十字摇晃，抽走DPBS
  3. 加入300ml的TP蛋白酶，细胞脱落后转移到50ml离心管💡 提示
  4. 根据需要铺板的点样数计算培养基的用量，用25ml移液管往50ml离心管中加入培养基，吹打混匀💡 计算示例
  5. 500 μL/孔，每加完一列重新吹打一下。
  6. 稍微摇荡均匀，保鲜膜封膜后，再次拍打均匀。
  7. 细胞长至80% ，进入转染。

2. 转染

  1. 调浓度设计，浓度要求误差小于 0.5，且跑胶确认 1 μL。💡 计算示例
  2. A、B 液设计。💡 A液计算示例
  3. A + B 混合10分钟室温。
  4. 加入细胞转染。
  5. 16h 换液：脚踏吸取，润洗上下通道后十分缓慢加入。
    • 选择抗性：blast、puro、zeocin
    • 抗性浓度：10 μg/mL（blast）

3. 收细胞

  1. 脚踏吸液，一般吸去上层。
  2. 加入 500 μL DPBS，直接吹打直至细胞全部脱落。💡 观察技巧
  3. 转移至 1.5ml 离心管，离心5000rpm 5min。
  4. 脚踏吸液，至吸光（不要吸走细胞团）。
  5. 加入 500 μL DPBS，震荡 15s 重悬。
  6. 离心5000rpm 5min ，吸取至吸光（不要吸走细胞团）。

三、PCR 鉴定与测序

1. Blue C 处理

  1. 用 25~30 μL Blue C 重悬细胞团。
  2. 转移至八联管，PCR 程序见 PCR 仪器。

2. 一轮 PCR

  1. 扩增体系：正常见普通 PCR（引物根据位点选择，注意加入水空白组，十分注意不要吸取到细胞）。
  2. 扩增程序：常见 56℃/58℃ 退火，延伸 15~20s。
  3. 跑 5 μL 胶，剩余 20 μL 按纯化表格混合。
  4. 磁珠纯化：使用前室温恢复 30min，吹打混匀，预热 ddH2O，10 μL 一个 sample。
  5. 测浓度，取部分调至 15 ng/μL，取 10 μL。

3. 二轮 PCR

  1. 扩增体系：正常见普通 PCR，扩增引物不同（引物通用 p2A-fw，rv 根据 index），注意加入水空白组。
  2. 扩增程序：与一轮一致。
  3. 跑 5 μL 鉴定，按纯化表格再次混合合并二轮产物。
  4. 送测，订单表格 + 纯化表格，泡沫箱 + 冰袋封装。