生物技术制药

第一章

名词解释

1.生物药物：是指运用微生物学、生物学、医学、生物化学等的研究成果，从生物体、生物组织、细胞、体液等，综合利用微生物学、化学、生物化学、生物技术、药学等科学的原理和方法制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。
2.生物技术药物：一般来说，采用DNA重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物。
3.生物技术制药：采用现代生物技术，借助某些微生物、植物、动物生产医药品。
生物技术药物的类型、特性及功能用途

类型：

①重组多肽和蛋白质类制剂
②基因药物，如基因治疗剂、基因疫苗、反义药物和核酶
③来自动物、植物、微生物和海洋生物的天然生物药物
④合成与部分合成的生物药物

特性：

·使用剂量少，活性高
·分子结构复杂，分子量较大
·稳定性较差，易失活或分解，体内半衰期短
·具有种属特异性
·具有免疫原性
·分析检验的特殊性

功能用途：

·治疗药物：重组蛋白质、抗体、血液制品
·预防药物：各种疫苗、类毒素等
·诊断药物：免疫/酶诊断试剂、单克隆抗体诊断试剂、放射性诊断药物、基因诊断药物。

生物技术制药的特征及研究领域

特征：四高一长，高技术、高投入、高风险、高利润、长周期
研究领域：癌症、遗传病、心脑血管病、传染病、神经退行性疾病、自身免疫性疾病和其他疾病

第二章

基因工程药物的分类及其代表产品

②重组多肽及蛋白质类药物：细胞因子、激素、酶、疫苗、抗体
②核酸类药物：DNA疫苗、mRNA疫苗、基因治疗
③重组活载体药物：活病毒疫苗、活细菌疫苗

基因工程操作的六字“真言”的含义

分：目的基因的制备（核酸分离技术）
切：限制性内切酶
连：DNA连接酶
转：重组DNA导入受体细胞
筛：利用载体的标记基因和报告基因筛选转基因生物
表：基因工程细胞表达目的蛋白

药物蛋白表达系统的优缺点

原核表达系统：

优点：快速生长，高产量。易于培养和操作。成本低。
缺点：不能进行复杂的翻译后修饰。不适用于复杂蛋白。

酵母表达系统：

优点：适用于小规模和中规模表达。生长速度较快，易于培养。
缺点：翻译后修饰能力有限。不适用于复杂翻译后修饰的蛋白。

昆虫表达系统：

优点：能够进行复杂的翻译后修饰，如糖基化。
缺点：相对复杂，成本较高。

哺乳动物表达系统：

优点：能够实现复杂的翻译后修饰，如糖基化，磷酸化。适用于大规模生产高质量蛋白。
缺点：成本较高。生长和培养相对复杂。

工程菌常用的发酵方法

分批培养，半连续培养（补料分批），连续培养，透析培养，固定化培养

如何提高发酵过程中工程菌的稳定性

选择合适宿主菌：大肠杆菌质粒较稳定；酿酒酵母的质粒不稳定
选择合适载体：小分子量高拷贝质粒较稳定
增加选择压力：加入抗生素；营养缺陷型培养基
分阶段控制培养：分为菌体生长阶段和基因表达阶段
控制培养条件：选择营养丰富的复合培养基、较低培养温度、较高溶氧度、维持稳定pH
选择固定化培养方式

重组蛋白分离纯化工艺的设计策略

①针对不同的产物表达形式采用不同的策略
②针对不同性质的重组蛋白选择不同类型色谱
③多种分离纯化技术联合运用
④合适的分离纯化介质的选择

代表性重组药物的生物学功能及其生产工艺

①胰岛素：

生物学功能：降低血糖；促进糖原、脂肪、蛋白质合成。
生产工艺：
1、屠宰动物→收集胰脏→提取胰岛素→胰岛素结晶→分离纯化→产品
2、大肠杆菌发酵→收集菌体→包涵体变复性→分离纯化→产品
3、酵母发酵→澄清→分离纯化→产品

②干扰素（IFN）：

生物学功能：抗病毒，抗肿瘤，免疫调节
生产工艺：体外诱生制备、人源转化细胞系培养、基因工程E.Coli发酵、工程CHO细胞系构建动物无限细胞系培养、假单胞杆菌工程菌发酵

③白细胞介素/白介素（IL）：

生物学功能：在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。
生产工艺：大肠杆菌表达生产

④促红细胞生成素（EPO）：

生物学功能：
促进骨髓内原始红细胞加速分化
促进有核红细胞加快成熟和血红蛋白合成
刺激网织红细胞和成熟红细胞的释放
稳定红细胞膜，提高红细胞膜的抗氧化能力
生产工艺：
人EPO基因的制备、表达载体的构建、构建表达EPO的细胞株、工程CHO细胞的培养工艺及其优化、重组EPO的分离纯化工艺及其优化。

第三章

名词解释

1.原代细胞：直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化而制得的细胞悬液。
2.二倍体细胞系：具备正常细胞特点：核型为2n，具有贴壁依赖和接触抑制现象，有限增殖能力，无致瘤性。
3.转化细胞系：异倍体、无限生命力和较短倍增时间、对培养条件和生长因子要求低，适合大规模工业化生产。
4.胚胎干细胞：是早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞，具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。
5.转基因动物：将特定的外源导入动物生殖细胞、胚胎干细胞或早期胚胎，使之稳定整合于动物的基因组并能遗传给后代的一类动物，
6.动物乳腺生物反应器：基于动物转基因技术，使目的基因定位表达于转基因动物乳腺细胞，转基因动物乳汁中合成药用蛋白的转基因动物的总称。

动物细胞的生理特性

①细胞的分裂周期长，一般为12~48h。
②细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象。
③正常二倍体细胞的生长寿命是有限的。
④动物细胞对周围环境十分敏感
⑤动物细胞对培养基的要求高
⑥动物细胞蛋白合成途径和修饰功能与细菌不同

生产用动物细胞系的类型及特点

原代细胞：直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化而制得的细胞悬液。
（鸡胚细胞，原代兔肾和鼠肾细胞，淋巴细胞）
二倍体细胞系：具备正常细胞特点：核型为2n，具有贴壁依赖和接触抑制现象，有限增殖能力，无致瘤性。
（人胚肺细胞，人胚胎成纤维细胞）
转化细胞系：异倍体、无限生命力和较短倍增时间、对培养条件和生长因子要求低，适合大规模工业化生产。
（CHO细胞，Vero细胞，BHK-21细胞，Namalwa细胞）
融合细胞系：两个或两个以上的细胞合并成一个细胞

三种转基因动物的制备流程

①显微注射法：受精卵的准备、基因导入、胚胎移植、幼鼠的鉴定
②胚胎干细胞介导法：提取ES细胞、导入目的基因、鉴定和筛选重组细胞，重组细胞注入胚胎，胚胎移植、幼鼠的鉴定
③核移植技术：外源基因导入供体细胞，整合入体细胞基因组；供体细胞核移植到去核的卵母细胞，重构胚胎；胚胎移植到代孕母体子宫，分娩得到转基因纯合体动物

动物细胞工程制药的研究趋势

改进表达载体：优化启动子、增强子、终止子和polyA序列，提高外源基因转录和翻译水平。增加基因拷贝数；选择高表达宿主细胞。
改进工程细胞和培养工艺：采用代谢工程技术改造生产用细胞系；改进培养工艺。
抑制细胞凋亡：培养基和氧的优化供应防止营养和氧的缺乏；用化学添加剂阻断细胞凋亡过程；采用抗细胞凋亡基因改造工程细胞。
改进翻译后修饰
转基因动物的研究
再生医学的研究

第四章

名词解释

1.毛状根：植物器官受到发根农杆菌感染后形成的根状组织
2.次级代谢产物：植物在生长过程中通过次级代谢途径产生的化学物质，如含氮化合物、酚类和萜类化合物等。
3.诱导子：植物抗病生理过程中诱发植物产生抗毒素和引起植物过敏反应的因子，包括侵染植物的微生物及植物细胞内的分子。

植物培养细胞不同阶段及其特征

延迟期：细胞数量接近恒定
加速期：细胞快速生长
对数期：最大生长率和蛋白质合成完全停止期之间
稳定期：细胞数量稳定

次级代谢产物的种类及其代表产品

含氮化合物：

生物碱：
含氮的碱性天然产物；
非蛋白氨基酸；
胺类；
生氰苷：由脱羧氨基酸形成的O-糖苷

萜类和甾醇类化合物：

由异戊烯单元构成

酚类化合物：

简单酚类：羟基取代的苯环化合物；
黄酮类：以苯色酮环为基础；
醌类：芳香二氧化合物

植物细胞培养生产次级代谢产物的技术路线

选择目标植物及其外植体→愈伤组织诱导→液体培养→培养条件的优化→反应器扩大培养→细胞或药物分离纯化

植物大规模细胞培养方法

成批培养法，半连续培养法，连续培养法，固定化培养

第五章

名词解释

1.抗体：是指机体免疫细胞被抗原激活后，由B淋巴细胞增殖分化的浆细胞所产生，可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
2.单克隆抗体：是由单一B淋巴细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体
3.基因工程抗体：利用基因工程技术对编码抗体的基因按不同需要进行加工改造和重新装配，经转染适当的受体细胞所表达的抗体蛋白，又称为重组抗体。
4.嵌合抗体：利用DNA重组技术将鼠源单抗L和H链可变区DNA片段插入含有人抗体恒定区DNA的表达载体中，转染宿主细胞后表达出的抗体蛋白。
5.人源化抗体（改型抗体/CDR植入抗体）：用鼠单抗CDR替代人抗体的CDR，使人源化抗体获得鼠单抗的抗原特异性，同时降低其免疫原性。
6.人源抗体：通过转基因或转染色体技术，将人类抗体基因全部转移至抗体基因缺失的动物中，使动物表达出人类的抗体，达到全人源化的目的。
7.Fab抗体：重链CH1-VH和完整轻链组成，保留了天然抗体Fv段结构
8.ScFv抗体：VH和VL通过连接肽首尾连接形成的Fv抗体
9.双特异性抗体：基因工程抗体的一种，具有两个不同的抗原结合位点，可同时结合两个靶抗原。
10.抗体偶联药物：通过化学链将小分子细胞毒素与单抗连接，单抗作为载体将小分子细胞毒素靶向运输到目标细胞中。
11.CAR-T：嵌合抗原受体T细胞

单克隆抗体的制备流程

动物体内诱生法：将降植烷注入Balb/c小鼠腹腔→注射106个杂交瘤细胞→越1~2周后抽取腹水，获取单克隆抗体
体外培养法：采用RPMI1640培养液悬浮培养→去除上清液的细胞及碎片→获取单克隆抗体

基因工程抗体的类型及优势

①嵌合抗体：降低免疫原性，保留抗体的特异性
②人源化抗体（改型抗体/CDR植入抗体）：免疫原性进一步降低，抗体亲和力降低，KD值下降了10倍
③全人源抗体：低免疫原性，高亲和力；排异反应最低，安全性最好；广泛的应用潜力
④小分子抗体片段：可以穿过血管壁或组织屏障渗透到肿瘤组织；免疫原性低，半衰期短，易从体内清除；制备免疫毒素或酶标抗体；可用大肠杆菌表达、成本低。
⑤双特异性抗体（双功能抗体）：同时识别两种抗原，提高了抗体的选择性和亲和力；特异性高、靶向性强，用药量少及毒副作用小。
⑥抗体偶联药物：兼具单抗高选择性、稳定性和良好的药物动力学特性；具有小分子细胞毒素的抗肿瘤能力。
⑦抗体融合蛋白

人源抗体的制备技术

噬菌体展示技术、转基因小鼠技术、单B细胞克隆技术

抗体药物纯化工艺

发酵液的预处理：

直流过滤技术、切向流过滤技术、碟片式离心机

抗体的色谱纯化工艺：

蛋白A色谱、蛋白G色谱

免疫诊断技术的类型及其原理

①凝聚反应：指颗粒性抗原或包被可溶性抗原的颗粒性载体与相应抗体特异性结合后，在电解质存在下出现肉眼可见的聚集现象。
②免疫沉淀反应：指可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合所出现的沉淀现象。
③荧光免疫技术：利用荧光标记的抗体作为探针，对组织或细胞内特定抗原进行定位和定性分析。
④放射免疫技术：将同位素示踪的高灵敏性与抗原抗体反应的高特异性相结合的免疫检测技术，一般用于激素、微量蛋白和肿瘤标志物的定量分析。、
⑤酶联免疫技术：用酶标记抗原或抗体，将免疫反应的特异性和酶高效催化的专一性相结合的免疫检测技术。
⑥化学发光免疫技术：将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合的检测技术。
⑦胶体金免疫层析：以胶体金作为示踪标志物的新型免疫检测技术。胶体金颗粒与protein A或IgG通过非共价键结合，形成胶体金标记物。

第六章

名词解释

1.疫苗：将细菌、病毒、立克次体等病原微生物及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或提取、基因表达等方法制成的用于预防、控制传染病的生物制品。
2.灭活疫苗：指对病毒或细菌进行培养后，通过物理或化学方法处理将其灭活从而获得无感染活性的一类疫苗。
3.减毒疫苗：指用弱毒性的、免疫原性强的病原微生物及代谢产物，经培养繁殖或接种于动物、鸡胚、组织或细胞，生长繁殖后制成的疫苗。
4.重组活载体疫苗：是指以无致病性的病毒或细菌为载体，将抗原蛋白基因插入载体构建的重组活载体，进入机体可激活免疫反应的生物制品。
5.核酸疫苗：指将抗原基因直接导入机体细胞内，在机体细胞中合成抗原蛋白，诱导机体产生免疫反应的生物制品。
6.DNA疫苗：将抗原基因重组到真核表达载体，重组载体直接注射机体内，使外源基因在细胞内表达抗原，从而激活免疫反应。
7.mRNA疫苗：利用载体将mRNA运输到机体细胞，转录出特异性抗原蛋白，刺激人体免疫系统产生抗体。

疫苗的组成成分

抗原、佐剂（adjuvant）、杀菌剂和防腐剂，保护剂或稳定剂，灭活剂，缓冲液、盐类等非活性成分。

疫苗的类型及其特点

按使用目的：预防性疫苗、治疗性疫苗
按生物材料：细菌系疫苗、病毒性疫苗、类毒素疫苗
按预防种类：单一疫苗、多价疫苗、联合疫苗
按是否纳入国家免疫规划：国家免疫规划疫苗、非免疫规划疫苗
按研制技术：
传统疫苗：减毒活疫苗、亚单位疫苗、灭活疫苗、结合疫苗
新型疫苗：合成肽疫苗、基因工程疫苗

疫苗研发的五条技术路线及其制备工艺

①灭活疫苗：病原体的培养→病原体的灭活→病原体的提取和纯化→疫苗的配制和包装→疫苗的质量控制
②减毒疫苗：接种病毒、特定的培养条件，观察细胞病变→收获病毒、去除细胞碎片，病毒滴定→原液合并或浓缩→半成品→加工制成疫苗用于口服
③亚单位疫苗：由多种抗原混合物组成
④重组载体疫苗：将致病病毒的基因插入腺病毒载体，获得重组腺病毒→纯化扩增疫苗制备
⑤核酸疫苗：测序筛选抗原基因→体外转录大量生产mRNA→形成mRNA纳米脂质颗粒→纯化→制备疫苗

第七章

名词解释

1.酶化学修饰：通过主链的切割、剪接和侧链基团的化学修饰对酶蛋白分子进行分子改造，以改变其理化性质及生物活性的技术。
2.固定化酶：指限制或固定于特点空间位置的酶。指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，又能发挥催化作用的酶制剂。
3.固定化细胞：指被限定或定位于特定空间位置的细胞。

产酶微生物的基本要求

不是致病菌，不易变异退化
发酵周期短，产酶量高
最好是产生胞外酶的菌种，利于分离
对医药和食品用酶，还应考虑安全性

酶化学修饰的方法

①酶表面化学修饰

大分子修饰、小分子修饰、交联修饰、固定化修饰

②酶分子内部修饰

非催化活性基团的修饰、蛋白质主链的修饰、催化活性基团的修饰、与辅因子有关的修饰、肽链伸展后的修饰

③结合定点突变的化学修饰

定点突变技术在酶关键活性位点引入1个氨基酸残基
化学修饰法将突变的氨基酸残基进行修饰，引入1个小分子化合物，获得一种新颖的酶制剂——化学修饰突变酶

酶的固定化方法

载体结合法：物理吸附法、离子结合法、共价结合法
交联法
包埋法：网格法、微囊法
热处理（细胞）

酶在医药领域的应用

1.酶的诊断：

根据体内原有酶活力的变化来诊断某些疾病（磷酸酶、肌酸激酶及其同工酶、γ谷氨酰基转移酶、腺苷脱氨酶、乳酸脱氢酶及其同工酶、血清淀粉酶及其同工酶）

2.诊断用酶：

用酶测定体液中某些物质量的变化诊断疾病

3.酶在疾病治疗方面的应用：

酶制剂广泛用于助消化、消炎、抗凝、促凝、抗癌、降压等
促进消化的酶：胃蛋白酶、胰酶、淀粉酶、纤维素酶、木瓜酶
用于消炎的酶：胰蛋白酶、糜蛋白酶、双链酶、α-淀粉酶
抗凝和促凝的酶：凝血酶、尿激酶、链激酶纤维蛋白溶解酶
治疗白血病的酶：L-天冬氨酸酶

酶在药物生产方面的作用

氨基酰化酶：首个工业化生产的固定化酶
葡萄糖异构酶：世界上生产规模最大的固定化酶
青霉素酰化酶：医药工业上广泛应用的固定化酶

第八章

发酵的类型

微生物菌体发酵、微生物酶发酵、微生物代谢产物发酵、微生物转化发酵、动植物细胞发酵

发酵工程药物的种类

抗生素类、氨基酸类、核苷酸类、维生素类、甾体类激素、多糖类、治疗酶及酶抑制剂

菌种选育方法

自发突变与定向培育、诱变育种、杂交育种、原生质体融合育种、基因工程育种